Penuntun Praktikum Biokimia

Penuntun Praktikum Biokimia    

   

N A M A                         :

N I M                     :

SEMESTER/KEL.  :

                                   

BAGIAN BIOKIMIA

Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin bekerjasama dengan Fakultas Kedokteran Universitas Muslim Indonesia

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas berkat dan rahmatNya sehubungan dengan terbitnya penuntun praktikum Biokimia untuk matakuliah Biomedik I.

Dengan perkembangan metode pendidikan dalam ilmu kedokteran umumnya dan Biokimia pada khususnya, maka penuntun praktikum yang diterbitkan kali ini  merupakan penuntun yang sebagian besar sama dengan penuntun praktikum sebelumnya hanya saja ada beberapa perbaikan yang disesuaikan dengan matakuliah 

Biomedik I.

Setiap kegiatan praktikum dalam penuntun praktikum ini diusahakan  sedapat mungkin berhubungan dengan teori yang diberikan pada kuliah Biokimia  Kedokteran, sehingga akan bermanfaat dalam memahami kuliah yang diberikan.

Kami menyadari bahwa penuntun praktikum ini masih jauh dari  kesempurnaan. Oleh karena itu petunjuk, saran dan kritik dari para pembaca  sangat kami harapkan demi perbaikan pada penerbitan berikutnya. Mudah-mudahan  penuntun ini memberikan manfaat yang sebaik-baiknya dalam peningkatan ilmu  pengetahuan mahasiswa kedokteran.

Makassar, 1 November  2010

                                                        Penyusun,

Staf Pengajar Bagian Biokimia

Fakultas  Kedokteran UNHAS

TATA TERTIB PRAKTIKUM BIOKIMIA

1. Mahasiswa dibagi atas dua kelompok yaitu kelompok A dan  kelompok B yang masing-masing terdiri atas beberapa regu. Setiap regu secara  bersama-sama melakukan jenis percobaan yang sama pada tempatnya masing-masing  dan tiap regu mahasiswa tidak dibenarkan mengambil pekerjaan regu mahasiswa  lainnya.
2. Mahasiswa yang berhak mengikuti praktikum adalah mereka  yang memenuhi persyaratan administrasi dan kelengkapan peralatan praktikum.
3. Mahasiswa  sudah harus berada di laboratorium paling lambat 10 menit sebelum praktikum  dimulai, bagi yang terlambat diperbolehkan  mengikuti praktikum atas persetujuan koordinator praktikum.
4. Mahasiswa  wajib mengisi absen praktikum yang disediakan dan tidak diperbolehkan keluar  masuk laboratorium tanpa seizin asisten yang bertugas pada saat itu.
5. Mahasiswa diwajibkan berpakaian rapi dan menggunakan  jas praktikum putih berlogo unhas yang dilengkapi dengan papan nama dan membawa  penuntun praktikum serta lembar kerja masing-masing.
6. Ketua regu beserta wakilnya menyiapkan alat-alat serta  bahan dan segala sesuatu yang dibutuhkan untuk percobaan yang akan dilaksanakan  dengan menghubungi asisten pembimbing yang bertugas pada saat itu.
7. Mahasiswa tidak dibenarkan membicarakan hal-hal yang  tidak berhubungan dengan praktikum selama dalam laboratorium demi efisiensi  waktu.
8. Setiap  mahasiswa harus memahami tujuan percobaan, cara kerja serta teori yang  berhubungan dengan percobaan yang akan dilaksanakan. Asisten berhak menunda  jalannya percobaan untuk sementara dan menganjurkan untuk memahami kembali  hal-hal yang disebutkan diatas sebelum praktikum dilanjutkan kembali. Jika  ternyata hal ini tetap tidak dipenuhi, maka praktikum dapat ditunda atau  dibatalkan.
9. Percobaan yang tidak berhasil dengan baik atau gagal  atas kesalahan regu atau anggota regu yang bersangkutan, diluar tanggung jawab  asisten pembimbing dan tidak diberikan kesempatan untuk mengadakan pengulangan

10.   Setiap  anggota regu bertanggung jawab atas keselamatan dan kebersihan alat-alat yang  digunakan  dan pada akhir percobaan alat diserahkan kembali dalam keadaan lengkap dan bersih.

11.   Setiap  mahasiswa wajib melaksanakan seluruh percobaan sesuai yang dijadwalkan oleh  laboratorium biokimia. Mahasiswa yang berhalangan dengan alasan yang tepat (surat keterangan dokter  harus disampaikan paling lambat satu hari sesudahnya) harus segera melaporkan  hal tersebut kepada koordinator asisten.

12.   Laporan  sementara hasil percobaan diselesaikan dalam Laboratorium selama praktikum  berlangsung dan menjadi bahan penilaian dasar dari asisten untuk setiap  praktikan.

13.   Buku lembar  kerja hasil percobaan diselesaikan setelah praktikum selesai dan dikumpulkan  selambat-lambatnya 3 x 24 jam setelah praktikum selesai. Bagi yang tidak  mengumpulkan buku lembar kerja hasil percobaan tidak berhak untuk mendaptkan  nilai praktikum biokimia system MDP.

14.   Buku  lembar kerja hasil percobaan praktikum tidak boleh hilang dan akan digunakan  pada percobaan biokimia praktikum biokimia selanjutnya

15.   Setiap  mahasiswa wajib mengikuti diskusi praktikum dengan asisten pembimbing  masing-masing

16.   Peraturan  yang tidak tercantum diatas dan dianggap perlu akan diberitahukan selanjutnya.

SPEKTROFOTOMETER

A.    PENDAHULUAN

Bila seberkas sinar putih melewati suatu larutan berwarna, maka pada beberapa panjang gelombang tertentu dari spektrum warna akan terjadi penyerapan cahaya. Contohnya, bila suatu larutan berwarna MERAH, maka ia akan menyerap cahaya pada daerah panjang gelombang warna KUNING-BIRU. Sebaliknya, cahaya pada daerah panjang gelombang  warna MERAH akan diteruskan sehingga dengan mata akan tampak berwarna MERAH.  Dengan kata lain, warna suatu larutan disebabkan oleh warna spektrum cahaya yang tidak ditahan/diserapnya, tetapi yang diteruskan.

Dalam keadaan sehari-hari, sebenarnya diketahui bahwa jumlah zat yang terlarut dapat diperkirakan dengan mata dari kepekaan/intensitas warna. Misalnya, dua sendok makan sirup merah dilarutkan dalam segelas air warnanya tampak lebih pekat dibandingkan dengan satu sendok makan sirup merah dalam segelas air.

Pada pengukuran dengan teknik spektrofotometri, cahaya polikromatis yang berasal dari sumber cahaya diuraikan dengan menggunakan prisma sehingga diperoleh cahaya monokromatis yang diserap oleh zat yang akan diperiksa tersebut. Hubungan antara konsentrasi dengan jumlah cahaya yang diserap dinyatakan dalam hukum Beer-Lambert.

Hukum Beer-Lambert

Bila cahaya monokromatis melalui satu larutan berwarna maka jumlah cahaya yang diserap menurun secara eksponensial, sebanding dengan :

a. Panjang lintasan/kolom cahaya yang melalui larutan

b. Kadar Zat terlarut dalam larutan yang menyerap cahaya

Secara matematis, hukum Beer-Lambert dapat dirumuskan sebagai berikut :

A = k x c x l

     A    = serapan/densitas optic, yaitu jumlah cahaya yang diserap

     k     = koefisien ekstingsi yaitu suatu senyawa dengan kadar 1 M pada    

   panjang gelombang tertentu dengan diameter kuvet/panjang larutan   

   yang dilalui cahaya 1 cm.

     c     = kadar sampel yang diperiksa

     l      = diameter kuvet/panjang larutan yang dilalui cahaya (1cm)

    karena k dan l merupakan bilangan tetap, maka A sebanding dengan c.

Pada setiap pengukuran/penetapan selalu :

1. Diperlukan larutan blanko

Larutan blanko mengandung semua pereaksi kecuali bahan yang   diperiksa. Blanko dimaksudkan untuk menghilangkan interfensi yang dapat disebabkan oleh zat lain yang terdapat dalam larutan yang menyerap cahaya pada panjang gelombang sama

2. Digunakan larutan standar sebagai pembanding

3. Dilakukan penetapan secara duplo

Penetapan larutan uji dan standar dilakukan dengan minimal ulangan dua kali (duplo) dengan maksud untuk memperkecil kesalahan.

Petunjuk penggunaan alat Spektrofotometer

1.   Putar tombol (1) ke kanan untuk mengaktifkan alat. Biarkan 15 menit untuk memanaskan alat. Atur tombol sampai menunjukkan angka 0 pada petunjuk % T.

2.   Putar tombol (2) untuk memilih panjang gelombang sesuai dengan   yang diinginkan

3.   Masukkan kuvet yang berisi paling seditkit 5 ml akuades ke dalam tempat  sample (sebelum memasukkan kuvet, pastikan bahwa dinding kuvet bagian luar dalam keadaan kering). Kemudian tutup penutup tempat sample.

4.   Putar  tombol (3) sehingga %T  menunjuk angka 100 atau sampai A menunjuk angka 0

5.   Angkat kuvet yang berisi akuades dari tempat sample. Kemudian ganti isi kuvet dengan larutan, baca hasilnya.

6.   Ganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau uji,  kemudian baca serapannya.

Catatan :

     1.    Setiap memasukkan kuvet kedalam tempat sample, bagian luar kuvet

            harus bersih & kering (gunakan kertas tisu untuk membersihkan)

     2.    Jangan sampai ada cairan yang tumpah kedalam alat.

     3.    Untuk setiap penetapan pada panjang gelombang yang berbeda, pada       

setiap alat harus ditera dengan akuades (A harus menunjukkan angka 0 atau 100%T)

B.    TUJUAN UMUM  PRAKTIKUM

1. Menentukan panjang gelombang dengan serapan maksimum

2. Membuktikan hukum Beer-Lambert

3. Penentuan kadar larutan yang tidak diketahui

C.    PERCOBAAN

1. Penentuan Panjang Gelombang dengan Serapan Maksimum

Tujuan: Menentukan panjang gelombang dengan serapan maksimum

Dasar:  Suatu zat berwarna menyerap  cahaya pada panjang gelombang tertentu

Alat dan Pereaksi:

1. Spektrofotometer dan Kuvet

2. Larutan hematin alkalis (1 ml darah diencerkan dengan amonia sampai     

    mencapai volume 500 ml)

Cara Kerja:

1. Sediakan 2 tabung kuvet, pada tabung 1 masukkan 5 ml akuades (sebagai  

    blanko) dan pada tabung 2 masukkan 5 ml larutan hematin alkalis

2. Baca serapan larutan itu pada panjang gelombang antara 500 dan 600 nm   

    dengan interval 10 nm. Perhatikan bahwa setiap pembacaan pada suatu

    panjang  gelombang. Alat ditera dengan blanko yang berisi akuades (A = 0  

    atau T = 100%)

3. Buatlah kurva dengan panjang gelombang sebagai sumbu X dan

    absorban sebagai sumbu Y

Hasil percobaan :

Panjang gelombang      Serapan             Panjang gelombang                  Serapan    

           (nm)                         (abs)                   (nm)                        (abs)

 500                                                                560 

 510                                                                570 

 520                                                                 580 

 530                                                                 590 

 540                                                                 600 

 550   

Tugas: Buatlah kurvanya pada kertas grafik (Kurva hubungan panjang gelombang (λ) – serapan (A))

Hasil:

...............................................................................................................................................................................................................................

 

...............................................................................................................................................................................................................................

...............................................................................................................................................................................................................................

2. Hubungan Serapan dengan Kadar Zat dalam Larutan

Tujuan: Membuktikan hukum Beer-Lambert

Dasar: Jumlah cahaya yang diserap suatu larutan pada panjang gelombang

tertentu sebanding dengan kadar zat dalam larutan. Bila hukum Beer-Lambert ini diikuti oleh larutan tersebut, maka kurva hubungan serapan (A) dengan kadar zat akan merupakan garis lurus.

Alat dan pereaksi:

1. Spektrofotometer dan kuvet

2. Darah oksalat

3. Pipet 1 ml

4. Labu Volumetrik 1000 ml

5. Tabung reaksi

6. Kertas grafik

Cara kerja:

1. Encerkan 1 ml darah oksalat dalam labu volumetric menjadi 500 ml

    dengan larutan amonium encer (4 ml amonia pekat dalam 1 L akuades)   

    Kocok dengan membolak-balikkannya (sudah dibuat/tersedia)

2. Pipetkan ke dalam 6 tabung reaksi masing-masing: 0ml; 2ml; 4ml; 6ml;  8ml 

    dan 10ml darah amonia tersebut. Kemudian tambahkan amonia encer

    pada keenam tabung berturut-turut: 10ml; 8ml; 6ml; 4ml; 2ml dan 0 ml

3. Kemudian baca serapan masing-masing tabung dengan menggunakan

    tabung 1 sebagai blanko pada panjang gelombang maksimum yang  

    didapat pada percobaan 1.

4. Buatlah kurva pada selembar kertas grafik dengan A (serapan) sebagai    

    sumbu Y & pengenceran sebagai sumbu X.

Hasil percobaan :

Darah Amonia/konsentrasi                        Amonia encer                       Serapan pada λ_maks     

      hematin alkali (%)     

   0 ml                                10 ml                                            …..

   2 ml                                  8 ml                                             …..

   4 ml                                  6 ml                                             …..     

   6 ml                                  4 ml                                             …..

   8 ml                                  2 ml                                             ….. 

 10 ml                                             0 ml                                             ….. 

Tugas :  Buatlah kurvanya pada kertas grafik

Pertanyaan :

1. Apakah anda mendapatkan garis lurus pada kurva yang anda buat?  

    Bagaimana bentuk kurvanya bila yang anda gunakan pada sumbu Y adalah

    Transmittance (T) ?

Jawab:

2. Apa yang harus anda lakukan bila serapan suatu tabung reaksi berisi larutan   

    yang sama berada diluar batas-batas  kurva yang anda buat ?

Jawab:

3. Penentuan Kadar suatu Larutan

Tujuan: Menentukan kadar sutau larutan yang belum diketahui

Dasar: Kadar suatu zat dapat diketahui dengan membandingkannya dengan kadar larutan standar

Alat dan pereaksi:

- Spektrofotometer                          -  Larutan hematin alkalis (U1, U2,  U3)

- Kuvet                                                                               

- Kertas grafik

- 3 buah tabung reaksi                                               

- Pipet  Mohr 10 ml

Cara kerja :

1. Siapkan 3 tabung reaksi yang  bersih dan kering. Isilah tabung pertama   

    dengan  5 ml larutan U1

2. Isilah tabung kedua  dengan  5 ml larutan U2

3. Isilah tabung ketiga  dengan  5 ml larutan U3

4. Baca serapan dan hitung kadar  larutan U1, U2 dan U3 berdasarkan kurva   

    standar yang saudara buat pada percobaan 2

Hasil percobaan :

Larutan          Serapan (Abs)                      Kadar (%)

   U1   

   U2   

   U3   

D. KESIMPULAN

Buatlah kesimpulan dari seluruh praktikum yang telah  diselesaikan.

PRAKTIKUM ENZIM

PENDAHULUAN

Enzim adalah sekelompok protein  yang berfungsi sebagai katalisator untuk berbagai reaksi kimia dalam sistem  biologis. Hampir setiap reaksi kimia dalam sistem biologis dikatalisis oleh  enzim. Sintesis enzim terjadi di dalam sel dan sebagian besar enzim dapat diekstraksi dari sel tanpa merusak fungsinya.

KEPENTINGAN MEDIS ENZIM

Enzim terdistribusi di tempat-tempat tertentu di dalam sel, kurang lebih sesuai dengan golongan dan fungsinya. Sebagai contoh, enzim-enzim yang berperan dalam sintesis dan reparasi DNA terletak di dalam inti sel. Enzim mengkatalisis berbagai reaksi yang menghasilkan energi secara aerob terletak di dalam mitokondria. Enzim yang berhubungan dengan biosintesis protein berada bersama ribosom. Dengan demikian reaksi kimia di dalam sel berjalan sangat terarah efisien.

Ada penyakit yang disebabkan oleh abnormalitas sintesis enzim tertentu,

misalnya pada defisiensi enzim Glukosa 6-Fosfat Dehidrogenase G6PDH/G6PD). Sel darah merah pada penderita defisiensi enzim G6PDH ini sangat rentan terhadap pembebanan oksidatif misalnya pada pemakaian obat analgetik tertentu dapat terjadi hemolisis intravaskuler.

Analisis enzim dalam serum pada dasarnya dapat dipakai untuk diagnosis berbagai penyakit. Dasar penggunaan enzim sebagai penunjang diagnosis ialah bahwa pada hakikatnya, sebagian enzim terdapat dan bekerja di dalam sel, dan enzim tersebut dibuat dalam jumlah besar oleh jaringan tertentu.

Karena itu enzim intrasel  seharusnya tidak ditemukan di dalam serum dan bila ditemukan berarti sel yang  membuatnya mengalami disintegrasi. Bila enzim yang diukur dalam serum terutama  dibuat oleh jaringan atau organ tertentu, maka peningkatan aktifitas dalam  serum menunjukkan adanya kerusakan pada jaringan atau organ tersebut.

PENGGOLONGAN ENZIM

Hal yang sangat penting bagi  enzim ialah kerjanya yang sangat  spesifik. Suatu

enzim dapat mengkatalisis satu atau beberapa reaksi saja. Meskipun jumlah enzim ada ribuan yang berasal dari makhluk hidup, reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh enzim-enzim ini ternyata dapat digolongkan ke dalam 6 macam reaksi saja.

Berdasarkan itu, para ahli telah menggolongkan enzim ke dalam  6 golongan, sesuai dengan jenis reaksi yang dikatalisis, yaitu :

1.  Oksidoreduktase

     Adalah kelompok enzim yang mengkatalisis reaksi-reaksi oksidasi reduksi.

2. Transferase

     Kelompok enzim ini mengkatalisis  reaksi pemindahan berbagai gugus seperti

     amina, karboksil, karbonil, metal, asil, glikosil/ fosforil.

3.  Hidrolase

     Kelompok enzim ini mengkatalisis  reaksi pemutusan ikatan kovalen sambil      

     menarik air.

4.  Liase

     Kelompok enzim ini mengkatalisis  reaksi pemecahan ikatan kovalen tanpa  

     mengikat air

5.  Isomerase

     Kelompok enzim ini mengkatalisis  reaksi isomerasi

6.  Ligase (Sintetase)

     Kelompok enzim ini mengkatalisis  pembentukan kovalen

Kespesifikan dari kerja enzim  dibedakan dalam kespesifikan optic dan gugus. Kespesifikan optic tampak pada  enzim-enzim yang bekerja terhadap karbohidrat. Umumnya enzim-enzim ini hanya  bekerja pada asam amino L dan bukan pada isomer D. Kespesifikan gugus  menunjukkan bahwa enzim hanya dapat bekerja terhadap gugus yang tertentu. Enzim  alcohol dehidrogenase tidak dapat mengkatalisis reaksi dehidrogenasi pada  senyawa bukan alkohol.

FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI ENZIM

Seperti molekul protein lainnya  sifat biologis enzim sangat dipengaruhi oleh faktor fisika-kimia. Enzim bekerja  pada kondisi tertentu yang relatif ketat.

Faktor-faktor yang mempengaruhi  kerja enzim antara lain suhu, pH, oksidasi oleh udara atau senyawa lain,  penyinaran ultraviolet, sinar X, α, β dan γ. Disamping itu, kecepatan reaksi  enzimatik dipengaruhi oleh konsentrasi maupun

substratnya.

Pengaruh Suhu

Suhu rendah mendekati titik beku tidak dapat merusak enzim, namun enzim tidak

dapat bekerja. Dengan kenaikan  suhu lingkungan, enzim mulai bekerja sebagian

dan mencapai suhu maksimum pada  suhu tertentu. Bila suhu ditingkatkan terus,

jumlah enzim yang aktif akan berkurang karena mengalami denaturasi. Kecepatan reaksi enzimatik mencapai  puncaknya pada suhu optimum (lihat grafik). Enzim dalam tubuh manusia mempunyai  suhu optimum sekitar 37^oC. Sebagian besar enzim menjadi tidak aktif  pada pemanasan ± 60^oC, karena terjadi denaturasi.

           

 

V

0      Suhu optimum 70^oC  T

Pengaruh pH

Enzim bekerja pada kisaran pH  tertentu. Jika dilakukan pengukuran aktifitas

enzim pada beberapa macam pH yang  berlainan, sebagian besar enzim di dalam tubuh akan menunjukkan aktifitas maksimum pada pH antara 5 sampai 9. Kecepatan reaksi enzimatik mencapai  puncaknya pada pH optimum (lihat grafik). Ada enzim yang mempunyai pH optimum  yang sangat rendah, seperti pepsin yang mempunyai pH optimum 2. Pada  pH yang jauh di luar pH optimum, enzim akan terdenaturasi.

Selain itu pada keadaan ini baik enzim maupun substrat dapat  mengalami

perubahan muatan listrik yang mengakibatkan enzim tidak dapat  berikatan dengan substrat.

           

V

0        pH optimum     = 14                    pH

Pengaruh konsentrasi enzim

Peningkatan konsentrasi enzim  akan meningkatkankecepatan reaksi enzimatik. Dapat dikatakan bahwa kecepatan  reaksi enzimatik (V) berbading lurus dengan

konsentrasi enzim (E). Makin besar konsentrasi enzim reaksi makin cepat (lihat

grafik).

 

v

 0                    (E)

Pengaruh konsentrasi substrat

Pada suatu reaksi enzimatik bila  substrat diperbesar, sedangkan kondisi lainnya

tetap, maka kecepatan reaksi (V)  akan meningkat sampai suatu batas kecepatan

maksimum (V). pada titik maksimum  ini enzim telah jenuh dengan substrat

membentuk kompleks enzim-substrat,  kemudian kompleks ini akan terurai menjadi enzim dan produk. Makin banyak  kompleks enzim-substrat terbentuk, makin cepat reaksi berlangsung sampai pada  batas kejenuhan enzim-substrat. Pada kondisi substrat melampaui batas kejenuhan kecepatan reaksi akan konstan. Dalam keadaan itu seluruh enzim sudah berada dalam bentuk kompleks enzim-substrat. Pada penambahan jumlah substrat tidak menambah jumlah kompleks enzim-substrat.

   

 V

    0                                            (S)

TUJUAN PRAKTIKUM

1.              Membuktikan pengaruh suhu terhadap aktifitas enzimatik

2.              Membuktikan pengaruh pH terhadap aktifitas enzimatik

3.              Membuktikan pengaruh kadar enzim terhadap aktifitas enzimatik

4.              Membuktikan kerja beberapa macam enzim

1. Pengaruh suhu terhadap kecepatan reaksi enzimatik.

Tujuan :  Membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik  sampai suhu tertentu

sebanding dengan kenaikan suhu, dan reaksi paling cepat  berlangsung pada suhu optimum.

Dasar : Suhu yang sangat rendah akan  menyebabkan terhentinya kerja enzim secara reversible, karena dalam keadaan  tersebut tidak terjadi benturan antara

partikel E dan S. Akibatnya kompleks E-S  yang sangat penting dalam reaksi

enzimatik tidak terbentuk, sehingga P juga  tidak terbentuk. Bila suhu dinaikkan

sedikit demi sedikit benturan E dan S  untuk membentuk kompleks E-S akan makin meningkat sehingga P yang terbentuk  makin banyak. Keadaan ini terjadi sampai pada suhu tertentu, yaitu suhu  optimum. Suhu yang lebih tinggi dari suhu

optimum menyebabkan enzim  terdenaturasi. Akibatnya meskipun benturan E dengan S meningkat, kompleks ES  tidak terbentuk karena enzim terdenaturasi. Akibatnya pembentukan P berkurang. Denaturasi enzim  dapat terjadi ireversibel terutama bila suhu lingkungan jauh melampaui suhu  optimum.

Bahan  dan pereaksi :

1.   Liur, sebagai sumber amylase. Tampunglah 2 ml air liur di dalam gelas  kimia/tabung reaksi  bersih & kering

2.   Liur 100x sebanyak 50 ml (pipet 0,5 ml liur + 49,5 ml aquadest)

3.   Larutan pati 0,4 mg/ml dan Larutan iodium

A)    Cara kerja

1)    Siapkan 6 pasang tabung reaksi yang bersih.

a.  Pasangan tabung pertama  ditempatkan dalam bejana yang berisi es (0 oC)

b.  Pasangan kedua ditempatkan dalam  bejana berisi air, yang suhunya  

     dipertahankan tetap pada 25 oC

c.  Pasangan tabung ketiga ditempatkan di rak tabung  pada suhu ruang

d.  Pasangan tabung keempat  ditempatkan dalam penangas air yang suhunya

     dipertahankan tetap pada 37 oC

e.  Pasangan tabung kelima  ditempatkan dalam penangas air yang suhunya

      dipertahankan tetap pada 60 oC

f.   Pasangan tabung keenam ditempatkan dalam penangas  air mendidih   

     (100^oC)

Tiap pasangan tabung diberi  tanda ‘B’ untuk blanko & ‘U’ untuk uji. Keram

pasangan tabung pada setiap  suhu selama paling sedikit 5 menit

2)   Pipetkan kedalam tiap-tiap tabung :

LARUTAN TABUNG B TABUNG U

Larutan pati 0,4 mg/ml 1 ml 1 ml

Keram pasangan tabung dari tiap suhu    minimal selama 5 menit

Liur    (diencerkan 100x) - 200 µl

Campurkan baik-baik, keram lagi dari    tiap suhu tepat 1 menit

Larutan iodium (untuk suhu 60oC dan 100 oC    penambahan dilakukan diluar

penangas) 1 ml 1 ml

Air suling 8 ml 8 ml

Segera baca serapan (A) pada  panjang gelombang 680 nm. Hitung selisih serapan

(∆A) antara tabung B (pada t =  0 menit) dengan tabung U dari tiap suhu.

3)    Buatlah tabel berikut ini :

SUHU Abs Blanko    (B)  Abs Uji (U) ∆Abs/MENIT    (V)

0 oC     

25 oC     

Suhu    ruang (…….oC)     

37 oC     

60 oC     

100 oC     

4)    Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan keceatan reaksi

enzimatik (v  = ∆Abs/menit) dengan suhu.

B)    Kesimpulan :

________________________________________________________________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

2.  Pengaruh pH  terhadap aktifitas enzim

A. Tujuan : Membuktikan bahwa keasaman (pH)  mempenguhi kecepatan

reaksi enzimatik.

B.  Dasar :  Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu dan menunjukkan 

kerja maksimum pada pH optimum. Di luar pH optimum aktifitas enzim dapat 

terganggu.

C. Bahan dan  pereaksi

1.   Liur, sebagai sumber amylase. Tampunglah 2 ml air liur di dalam gelas  kimia/tabung reaksi bersih & kering

2.   Liur 100x sebanyak 50 ml (pipet 0,5 ml liur + 49,5 ml aquadest)

3.   Larutan pati 0,4 mg/ml dilarutkan dalam berbagai pH (1, 3, 5, 7, 9 dan  11)

4.   Larutan iodium

D.    Cara kerja

1.    Siapkan 6 pasang tabung reaksi bersih. Tiap pasangan tabung diberi  tanda ‘B’ untuk blanko dan ‘U’ untuk uji

2.    Pipetkan kedalam tiap-tiap tabung :

LARUTAN TABUNG B TABUNG U

Larutan pati dgn berbagai pH (1, 3, 5, 7, 9, 11) 1 ml 1 ml

Keram pasangan tabung pada suhu 37^oC minimal selama 5 menit

Liur    (diencerkan 100x) - 200 µl

Campurkan baik-baik, keram lagi pada  suhu 37 oC tepat 1 menit

Larutan    iodium 1 ml 1 ml

Air suling 8 ml 8 ml

3.   Segera baca serapan (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung

selisih  serapan (∆A) antara tabung B (pada t = 0 menit) dengan tabung U dari

tiap pH

4.   Buatlah tabel berikut ini :

pH Abs Blanko    (B) Abs Uji    (U) ∆Abs/MENIT    (V)

1     

3     

5     

7     

9     

11     

5.              Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan kecepatan  reaksi

enzimatik (v = ∆Abs/menit) dengan pH.

E.    Kesimpulan :

________________________________________________________________________________________________________________________________________

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

3.      Pengaruh  kadar enzim terhadap aktifitas enzim

A.          Tujuan:Membuktikan bahwa kecepatan  reaksi enzimatik berbanding

lurus dengan konsentrasi enzim

B.            Dasar : Pada konsenrasi substrat tertentu, penambahan enzim 

dengan konsentrasi bertingkat akan meningkatkan  pembentukan kompleks

enzim-substrat, sehingga  jumlah produk yang terbentuk akan meningkat.

C.    Bahan dan  pereaksi

1.                Liur, sebagai sumber amylase. Tampunglah 2 ml air liur di

dalam gelas kimia/tabung reaksi yang  bersih dan kering

2.              Liur 100x sebanyak 50 ml (pipet 0,5 ml liur + 49,5 ml aquadest)

3.              Liur 200x sebanyak 1 ml (pipet 0,5 ml liur 100x + 0,5 ml

aquadest)

4.              Liur 300x sebanyak 3 ml (pipet 1 ml liur 100x + 2 ml aquadest)

5.              Liur 400 x sebanyak 2 ml (pipet 0,5 ml liur 100x + 1,5 ml

aquadest)

6.              Liur 500x sebanyak 5 ml (pipet 1 ml liur 100x + 4 ml aquadest)

7.              Larutan pati 0,4 mg/ml dan Larutan iodium

D.    Cara kerja

1.                Siapkan 5 pasang tabung reaksi yang bersih. Tiap pasangan

tabung diberi tanda ‘B’ untuk blanko  dan ‘U’ untuk uji

2.              Pipetkan kedalam tiap-tiap tabung :

LARUTAN TABUNG B TABUNG U

Larutan    pati 0,4 mg/ml 1 ml 1 ml

Keram pasangan tabung pada suhu 37 oC    minimal selama 5 menit

Liur dengan pengenceran 100x, 200x, 300x, 400x dan    500x - 200 µl

Campurkan baik-baik, keram lagi pada    suhu 37 oC tepat 1 menit

Larutan    iodium  1 ml 1 ml

Air suling 8 ml 8 ml

3.                Segera baca serapan (A) pada panjang gelombang 680 nm. Hitung

selisih  serapan (∆A) antara tabung B (pada t = 0 menit) dengan tabung U dari

tiap  konsentrasi enzim.

4.      Buatlah tabel  berikut ini :

Pengenceran    Enzim Abs Blanko    (B) Abs Uji    (U) ∆Abs/MENIT    (V)

500x     

400x     

300x     

200x     

100x     

5.              Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan kecepatan reaksi

enzimatik (v =  ∆Abs/menit) dengan konsentrasi enzim.

   

E.    Kesimpulan :

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

………………………………………………………………………………………………...

4.      Kerja  beberapa macam enzim

A.    Enzim Urease

Pada percobaan ini, sebagai enzim digunakan urease yang terdapat dalam  kacang

kedelai. Urease merubah uream menjadi CO2 dan NH3.  Terbentuknya NH3 dapat

dilihat dengan perubahan warna dari  fenolftalein. Larutan urease dibuat sebagai

berikut : Campurkan 1 gram tepung  kedelai dengan 100 ml aquadest dan dikocok

selama 10 menit, lalu disaring  dengan kain kasa, tiap kali praktikum baru

dibuat.

    1. Siapkan sebuah tabung reaksi bersih dan      kering. Masukkan 5 ml larutan

ureum 1%. Tambahkan 1 tetes fenolftalein 1%.      Kemudian tambahkan 1 ml

larutan urease dan ditutup. Setelah beberapa      menit, cairan yang tadinya

tidak berwarna akan berwarna merah oleh karena      terbentuknya amoniak.

    2. Percobaan diatas kita kerjakan lagi dengan      larutan urease yang telah

dipanaskan hingga mendidih dan didinginkan      kembali. Dengan prosedur

sebagai berikut:

-                    Siapkan tabung reaksi yang berisi  urease 3 ml, panaskan

hingga mendidih dan didinginkan

-                    Siapkan lagi tabung reaksi bersih  & kering. Masukkan 5 ml

larutan ureum 1%. Tambahkan 1 tetes fenolftalein 1%

-                    Lalu masukkan 1 ml larutan urease  yang telah dipanaskan &

didinginkan diatas dan ditutup. Disini tidak akan  timbul warna merah karena

pada pemanasan urease tadi menyebabkan enzim menjadi  tidak aktif

c.                  Percobaan diatas kita kerjakan lagi  dengan larutan urease

yang telah ditetesi larutan sublimat (HgCl2 1%). Cara kerjanya sebagai berikut:

-                    Siapkan tabung reaksi yang berisi 2 ml urease dan tambahkan 

1 tetes larutan sublimat (HgCl2 1%)

-                    Siapkan lagi tabung reaksi bersih  dan kering. Masukkan 5

ml larutan ureum 1%. Tambahkan 1 tetes fenolftalein 1%.  Lalu masukkan 1 ml

larutan urease yang telah ditetesi sublimat

-                    Disini tidak akan timbul warna merah karena logam-logam 

berat menyebabkan denaturasi enzim.

d.              Gambarlah hasil percobaan dari ke-3 tabung tersebut.

e.              Kesimpulan :

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

B.    Enzim  Schardinger dalam susu

Dalam susu  terdapat semacam enzim dehidrogenase yaitu Schardinger. Enzim ini

sanggup mengambil  hydrogen dari aldehid dan sebagai H akseptor digunakan biru

metil. Percobaan  ini menggunakan campuran biru metil dan formaldehid yang

dibuat dari 25 mg biru  metil dilarutkan dalam 195 ml akuades dan kedalamnya

ditambahkan 5 ml  formaldehyde 40 %.

Sediakan 3 tabung reaksi yaitu  tabung a, b, dan c

1.              Tabung reaksi a diisi dengan 5 ml susu ditambah dengan 5 tetes

campuran  biru metil dan formaldehyde kemudian dikocok. Kemudian ditambahkan

sejumlah  parafin liquid

2.              Tabung reaksi b diisi dengan 5 ml susu ditambah tetes campuran

biru  metil dan  formaldehyde

3.                Tabung reaksi c diisi dengan 5 ml susu yang terlebih dahulu

dimasak dan  didinginkan kembali ditambahkan 5 tetes campuran biru metil dan

formaldehyde  kemudian dikocok. Kemudian  tambahkan sejumlah parafin liquid

4.              Ketiga tabung reaksi tersebut dimasukkan kedalam penangas air

pada suhu  37 – 40 oC

5.              Gambarlah hasil percobaan dari ketiga tabung tersebut. Buatlah 

kesimpulan dari setiap percobaan

Hasil :

Kesimpulan :

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

……………………………………………………………………………………………..….

C.    Enzim peroksidase susu

Susu mengandung suatu enzim  peroksidase yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi :

H2O2                            H2O + On

Untuk menunjukkan  adanya enzim ini dapat dipakai benzidin yang bila teroksidasi

akan menimbulkan  warna biru atau guaiak yang bila teroksidasi akan berwarna

merah. Kedalam  tabung reaksi dimasukkan 3 ml susu ditambah 1 ml larutan guaiak

dan 1 ml  larutan H2O2 3%. Setelah dikocok akan timbul warna merah.

Hasil :

Kesimpulan  :

DAFTAR PUSTAKA

1.              Murray RK, etal. Biokimia Harper ed.25. Jakarta: EGC. 2003

2.              Stryer L. Biokimia ed.3.vol.1.Jakarta:EGC.1999

3.              Stryer L.Biokimia ed.3.vol2.Jakarta:EGC.1999

4.              Pedoman kerja Boerhringer Mannheim.1982

5.              Pedoman Kerja Dyasys.2002/2003

6.              Penuntun Kerja Roche.1985

7.              Penuntun Praktikum Biokimia Kedokteran Gigi Bagian Biokimia FKUH 

Makassar 2004

8.              Penuntun Praktikum Biokimia I Bagaian Biokimia FKUH. Makassar:

2002

9.              Biokimia Eksperimen Laboratoium bagian Biokimia FKUI.

Jakarta:Widya  Medika.2001. Hal.82-87

10.      Penuntun Praktikum Biokimia II  bagian Biokimia FKUH Makassar 2002.

LARUTAN PEYANGGA

A.          PENDAHULUAN

Pada umumnya proses biologi yang terjadi di dalam  sel berada pada suatu

lingkungan yang berair. Air adalah suatu substansi  amfoterik yang dapat

berperan sebagai donor/penyedia proton (asam) atau  penerima proton (basa).

Dalam air murni, [H+] = [OH-] =  [10-7]. Dengan kata lain. pH atau –log [H+] = 7

   

H2O      ==========    H+    +  OH-

Molekul  asam dan basa ketika bercampur dalam air pada suatu sel biologi atau

pada  tabung uji akan bereaksi sehingga dapat terjadi perubahan pH. Proses

reaksi  biokimia dalam sel atau jaringan sangat bergantung pada regulasi

konsentrasi  hydrogen. pH secara biologis dipelihara pada suatu nilai konstan

oleh penyangga  alami.

Suatu  larutan penyangga adalah larutan yang terdiri dari campuran asam lemah 

dengan  basanya atau basa lemah dengan  asamnya. Penyangga ini berfungsi

mempertahankan pH sehingga penambahan sejumlah  kecil asam atau basa memberikan

pengaruh sangat kecil.

Persamaan Henderson - Hasselbalch

pH = pKa + log [garam] / [asam]

Persamaan  ini menunjukkan hubungan antara pH dan rasio asam dan konsentrasi

basa yang  terkonjugasi. Persamaan ini dapat digunakan untuk menentukan pH dari

suatu  larutan jika perbandingan molar dari penyangga ion ([HA] / [A-])  dan 

pKa dari HA diketahui.  Perbandingan HA terhadap A- yang diperlukan untuk

mempersiapkan  larutan penyangga pada suatu pH yang spesifik dapat dihitung jika

pKa diketahui.

Asam  (H+) yang ditambahkan pada larutan penyangga, akan ternetralisir  oleh A-

:

                                                H+    +    A-      →    HA

Basa (OH-) yang ditambahkan  pada larutan penyangga akan dinetralisir oleh HA :

      OH+    +    HA      →    A-      +      H2O

System  penyangga yang paling efektif mengandung konsentrasi asam yang sama, HA

dan  basa terkonjugasinya, A-. Berdasarkan persamaan Henderson –  Hasselbalch,

ketika [A-] sebanding dengan [HA], pH sebanding dengan  pKa. Jarak efektif dari

suatu system penyangga pada umumnya 2 pH unit.

B.    PERCOBAAN

I.      Penyangga Standar Asetat

Alat dan Bahan :

-          pH meter

-          tabung reaksi

-          asam asetat 0,1 N

-          natrium asetat 0,1 N

Cara  Kerja :

1.      Siapkan 4 tabung, berikan label nomor tabung

2.      Masukkan asam asetat 0,1 N dan natrium asetat 0,1 N ke  dalam setiap

tabung dengan jumlah sesuai dengan table di bawah ini :

Hasil :

No. tabung ml asam asetat 0,1N ml natrium asetat 0,1 N pH

1 18,5 1,5 

2 14,7 5,3 

3 4,2 15,8 

4 1,9 18,1 

    1. Tentukan      pH dari larutan diatas dengan menggunakan persamaan

Handerson-Hasselbach!

    1. Tentukan      pH dari larutan diatas dengan menggunakan pH-meter

II.          Larutan pH  dalam berbagai pH

Alat dan bahan :

-          pH meter

-          tabung reaksi

-          kalium klorida 0,2 M

-          asam asetat 0,1 N

-          kalium ftalat

Cara kerja :

    1. Siapkan      5 tabung dan berikan tanda pada setiap tabung sesuai dengan pH

    2. Tambah      ke dalam setiap tabung larutan sesuai dengan table di bawah ini

:

Hasil :

pH Larutan garam Larutan asam/alkali Larutan Pati 2%

1 5 ml KCl 0,2M 8 ml HCl 0,2N 

3 5 ml Kalium ftalat 0,02M 2 ml HCl 0,2N 

5 5,9 ml asam asetat 0,1N 14,1 ml natrium asetat 0,1N 

7 6,1 ml M/15 dinatrium phosphate 3,9 ml M/15 kalium asam phospat 

9 5 ml asam borat 0,2 M  2,1 ml NaOH 0,2 N 

Setelah itu tambahkan aquadest hingga volume larutan menjadi  20 ml

Untuk membuat 20 ml larutan pati 0,4 gr/ml, berapakah jumlah  larutan pati 2%

yang harus ditambahkan?

MEMBRAN BIOLOGI

Hemolisis sel darah merah

Tujuan : Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah  dapat mengalami lisis

dalam pelarut organik.

Dasar : Membran sel darah merah (SDM) antara lain  mengandung lipid. Bila SDM

dimasukkan ke dalam larutan yang mengandung pelarut  organik, maka lipid membran

akan larut, sehingga terjadi hemolisis.

Bahan dan pereaksi :

1.              Suspensi darah

2.              NaCl 0,9%

3.              kloroform

4.              eter

5.              aseton

6.              toluen

7.              alkohol

8.              tabung reaksi

Pelaksanaan :

1.              Ke dalam 6 tabung reaksi dimasukkan masing-masing 10 mL  NaCl

0,9%. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol, dan kelima tabung lainnya 

tambahkan masing-masing 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen dan alkohol 

berurutan lalu tutup.

2.              Tambahkanlah kedalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah  dan

tutup, campur dengan membaliknya perlahan-lahan, biarkan selama setengah  jam

(jangan dikocok). Perhatikan warna yang terbentuk pada larutan bagian atas  &

bandingkan dengan kontrol.

Hasil  percobaan :

Pelarut  Hemolisis

Kontrol (NACl 0,9%) 

Kloroform 

Eter 

Aseton 

Toluen 

Alkohol 

Kesimpulan :

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah merah

Tujuan : Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik  terhadap membran sel

darah merah.

Dasar : SDM akan mengkerut bila  berada dalam larutan hipertonik terhadap

tekanan osmotik plasma. Dalam larutan  yang hipotonik, cairan dari luar sel

masuk ke dalam sel sehingga SDM akan  membengkak, dan akhirnya terjadi

hemolisis. Hemoglobin dalam SDM akan larut  dalam larutan, sehingga memberi

warna merah jernih pada larutan.

Bahan dan pereaksi :

1.      Suspensi darah

2.      NaCl 2%

Pelaksanaan :

1.      Ke dalam 10 tabung reaksi isikan  campuran berikut ini:

Tabung  Air suling (ml) NaCl 2% (ml) % NaCl

1.                  10,0 0,0 

2.                  9,0 1,0 

3.                  8,0 2,0 

4.                  7,5 2,5 

5.                  7,0 3,0 

6.                  6,5 3,5 

7.                  6,0 4,0 

8.                  5,5 4,5 

9.                  5,0 5,0 

10.            4,5 5,5 

2.              Campur dengan baik. Tambahkan 2 tetes suspensi darah ke  dalam

setiap tabung & campur dengan membaliknya perlahan-lahan. Diamkan  selama 1 jam.

Perhatikan dan catat derajat hemolisis pada tiap-tiap tabung.

Hasil percobaan :

Tabung no. Kadar NaCl Hemolisis

1.                     

2.                     

3.                     

4.                     

5.                     

6.                     

7.                     

8.                     

9.                     

10.               

Kesimpulan :

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Pertanyaan :

1.      Apakah yang dimaksud dengan  hemolisis?

2.      Berapakah resistensi osmotik  minimum SDM?

Jawaban:

________________________________________________________________________